Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用。Caspase 1是 Caspase 家族中唯一可以剪切IL-1前体蛋白或 IL-18前体产生相应成熟的Caspase。Caspase 1可以通过剪切其凋亡来调节细胞凋亡, 并通过其对一些细胞因子前体的剪切来调控相 关免疫反应。
本试剂盒是基于Caspase 1可以催化底物Ac-YVAD-pNA（acetyl-Tyr-Val-Ala-Asp p-nitroanilide）产生的黄色的pNA(p- nitroaniline）, 从而可以通过测定吸光度来检测Caspase 1的活性。pNA在405nm附近有强吸收峰。
试剂盒中提供了Caspase 1催化产生的黄色产物NA , 可以作为定量Caspase 1 酶活性的标准品。
包装信息：
一、准备工作：
1. 裂解液溶解后混匀并置于冰浴上备用。
2. 检测缓冲液溶解后混匀并置于冰浴上备用。
二、测定 NA标准曲线：
1. 标准品稀释液的配制 : 按照每0.9 ml检测缓冲液加入0.1 ml裂解液的比例配制适量的标准品稀释液。
2. 把试剂盒提供的 pNA（10 mM）用标准品稀释液稀释为0、10、20、50、100和200 μM，作为标准品。
3. 每个浓度取100 μl用酶标仪进行检测，或取适当量用容量不超过100μl的分光光度检测杯进行检测，测定A405。
4. 每一个标准品的A405减去不含pNA的空白对照的A405计算出实际的因pNA而导致的吸光度，并制作出 pNA 浓度相当于A405的标 准曲线。
三、样品的收集：
1. 对于悬浮细胞：把没有诱导凋亡的对照样品和诱导凋亡的样品，1000 rpm 4℃离心5min收集细胞，小心吸除上清，同时确保尽量 没有细胞被吸除，PBS 洗涤一次。同前吸尽上清后，按照每200万细胞加入100 μl裂解液的比例加入裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解15 min。下转步骤3-4。
2. 对于贴壁细胞：吸取细胞培养液，备用。用胰酶消化贴壁细胞，并收集至备用的细胞培养液中。1000 rpm 4℃离心5 min收集细胞 , 小心吸除上清 , 同时确保尽量没有细胞被吸除，同前吸尽上清后，按照每200万细胞加入100 μl裂解液的比例加入裂解液，重悬沉淀， 冰浴裂解15 min。下转步骤3-4。
3. 对于组织样品 : 按照每10 mg组织加入100 μl裂解液的比例加入裂解液，在冰浴上用玻璃匀浆器匀浆。然后把匀浆液转移到1.5ml离心管中，冰浴再裂解5 min。
4. 4℃ 12000 rpm离心15 min。
5. 把上清转移到冰浴预冷的离心管中。
6. 立即测定 Caspase 1 的酶活性或-70℃保存样品。同时可以取少量样品用 Bradford 法测定蛋白浓度，尽量使蛋白浓度达到1-3 mg/ml，相当于每10 μl待测样品中含有10-30 μg蛋白。如果细胞较小，可以适当增加细胞的用量。
四、Caspase 1酶活性的检测：
1. 取出 NA 和适量的 Ac-YVAD-pNA（2mM），置于冰浴上备用。
2. 如下设置反应体系：
注 : ①在设置反应体系时先加检测缓冲液 , 再加待测样品 , 适当混匀 , 注意避免在混匀时产生气泡。随后再加入10 μl Ac-YVAD-pNA（2m M）。
②在测定组织样本时，可以加大样本量，一般为2-4倍。
3. 加入 Ac-YVAD-pNA（2mM）后混匀，注意避免在混匀时产生气泡。37℃孵育2-4h。发现颜色变化比较明显时即可测定 A405。如果颜色变化不明显，可以适当延长孵育时间，甚至可以孵育过夜。
4. 样品的A405扣除空白对照的 A405，即为样品中 Caspase 1 催化产生的pNA产生的吸光度。通过同步骤二中获得的标准曲线的对比就可以 计算出样品中催化产生了多少量的 pNA。
