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产品概述

细胞在发生凋亡时,会激活一些DNA内切酶,这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提 DNA进行电泳检测,可以发现180-200bp的DNA ladder。基因组DNA断裂时,暴露的3'-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT)的催化下加上绿色荧光探针FITC标记的dUTP,之后经过POD转换试剂将信号转化成显色反应,方便结果的分析与保存。

Tunel细胞凋亡检测试剂盒不依赖生物素系统进行末端标记,避免了内源性生物素产生的高背景等问题。

包装信息

Tunel细胞凋亡检测试剂盒(显色法)029-1.png


操作流程

1. A. 对于贴壁细胞:(最好用细胞爬片)

a. 接种于24/48/96孔板的细胞用PBS漂洗5min。
b. 预冷的4%多聚甲醛于4℃固定细胞30-60min。
c. PBS漂洗细胞3次,每次5min。
d. 加入含0.1%-0.2% Triton X-100 的 PBS(现用现配),冰浴2-5min。
e. 转至步骤2。
1. B. 对于悬浮细胞:
a. 收集0.5-2×106 个细胞,PBS漂洗一次,1000rpm 离心5min 。
b. 预冷的4%多聚甲醛于4℃固定细胞30-60min。
c. PBS漂洗一次1000rpm 离心5min。
d. 加入含0.1%-0.2% Triton X -100的PBS(现用现配),冰浴2-5min 。
e. 转至步骤2。
1. C. 对于石蜡切片:
a. 脱蜡,组织切片置于60℃恒温箱,烤片30-60min,浸入装有新鲜二甲苯的染色缸,室温放置15min。浸入另一个装有新鲜二甲苯的染色缸,重复一次。
b. 洗涤,组织切片浸入100%乙醇染色缸,室温放置10min。浸入另一个100%乙醇染色缸,重复一次。
c. 水化,组织切片浸入梯度浓度乙醇溶液(90%,80%,70%,50%),室温下每步放置3min。
d. 组织切片浸入PBS,室温放置5min。

e. 组织切片用柠檬酸缓冲液(PH=6.2)进行中火修复5min。(对于有些组织可以用1xProteinase K进行通透,即每个组织滴加50μl用PBS稀释的1×Proteinase K,室温静置15-30min,具体通透时间因组织而异,需要自行摸索)

Tunel细胞凋亡检测试剂盒(显色法)029--2.png

f. 组织切片浸入PBS室温放置5min重复漂洗3次,如果用Proteinase K通透则必须彻底去除残留Proteinase K否则影响后续实验结果。
g. 转至步骤2。
1. D. 对于冰冻切片:
a. 预冷的4%多聚甲醛于4℃固定切片30-60min。
b. 组织切片浸入PBS,室温放置5min,重复漂洗2次。
c. 组织切片用柠檬酸缓冲液(PH=6.2)进行中火修复5min。
d. 组织切片浸入PBS室温放置5min重复漂洗3次,如果用Proteinase K通透则必须彻底去除残留Proteinase K,否则影响后续实验结果。
e. 转至步骤2。
2. 每个组织或细胞样本滴加50μl 3%H2O2,室温避光静置10min。

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3. 组织切片或细胞浸入PBS,室温避光放置5min,重复漂洗2次。
4. 阳性对照(选做):阳性对照的组织滴加50μl阳性对照缓冲液 (24孔板每孔大概需要100-150μl)室温静置10min,浸入PBS,室温放置5min,重复漂洗3次。

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注:为避免交叉污染,阳性对照组请用单独的染色缸漂洗!
5. 每个组织滴加50μl Tunel反应缓冲液(24孔板每孔大概需要100-150μl),37℃,避光孵育60-90min。

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6. 阴性对照(选做):用于进行阴性对照的组织或细胞滴加不含10×Enzyme Reagent的Tunel反应缓冲液(45μl1×Labeling Substrate与5μl去离子水混合),37℃,避光孵育60-90min。
7. 组织切片或细胞浸入PBS,室温放置5min,重复漂洗3次。
8. 每个组织滴加50μl POD转换缓冲液(24孔板每孔大概需要100-150μl),37℃,孵育30min。

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9. 组织切片或细胞浸入PBS,室温放置5min,重复漂洗3次。
10. 每个组织或细胞样本滴加50 μl DAB显色剂(24孔板每孔大概需要100-150),室温孵育2-5min,根据实际显色情况自行摸索显色时间。

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11. 复染细胞核:用苏木素复染细胞核(组织染色1min,细胞染色数秒)。 

12. A. 对于贴壁细胞或细胞涂片。

蒸馏水返蓝后用50%甘油封片,随即进行显微镜观察。

12. B. 对于切片:

用1%盐酸酒精分化数秒,自来水返蓝。之后进行以下步骤:

a. 脱水,组织切片浸入梯度浓度乙醇溶液(50%,70%,80%,90%),室温下每步放置3min。

b. 洗涤,组织切片浸入100%乙醇染色缸,室温放置10min。浸入另一个100%乙醇染色缸,重复一次。

c. 透明,组织切片浸入装有新鲜二甲苯的染色缸,室温放置15min。浸入另一个装有新鲜二甲苯的染色缸,重复一次。

d. 中性树胶封片,通风橱内晾干,置于显微镜下观察 。

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