简述实验条件：1. 裂解液溶解后混匀并置于冰浴上备用。
2. 检测缓冲液溶解后混匀并置于冰浴上备用。
二、测定 NA标准曲线:
1. 标准品稀释液的配制 : 按照每0.9ml检测缓冲液加入0.1ml裂解液的比例配制适量的标准品稀释液。
2. 把试剂盒提供的 NA(10mM)用标准品稀释液稀释为0、10、20、50、100和200μM,作为标准品。
3. 每个浓度取100μl用酶标仪进行检测,或取适当量用容量不超过100μl的分光光度检测杯进行检测,测定A405。
4. 每一个标准品的A405减去不含 NA的空白对照的A405计算出实际的因 NA而导致的吸光度,并制作出NA浓度相当于A405的标准曲线。
三、样品的收集:
1. 对于悬浮细胞:把没有诱导凋亡的对照样品和诱导凋亡的样品,1000rpm4°C离心5min收集细胞,小心吸除上清,同时确保尽量没有细胞被吸除,PBS洗涤一次。同前吸尽上清后,按照每200万细胞加入100μl裂解液的比例加入裂解液,重悬沉淀,冰浴裂解15min。下转步骤3-4。
2. 对于贴壁细胞:吸取细胞培养液,备用。用胰酶消化贴壁细胞,并收集至备用的细胞培养液中。1000rpm4°C离心5min收集细胞, 小心吸除上清, 同时确保尽量没有细胞被吸除,同前吸尽上清后,按照每200万细胞加入100μl裂解液的比例加入裂解液,重悬沉淀,冰浴裂解15min。下转步骤3-4。
3. 对于组织样品: 按照每10mg组织加入100μl裂解液的比例加入裂解液,在冰浴上用玻璃匀浆器匀浆。然后把匀浆液转移到1.5ml离心管中,冰浴再裂解5min。
4. 4°C12000rpm离心15min。
5. 把上清转移到冰浴预冷的离心管中。
6. 立即测定Caspase 3的酶活性或-70°C保存样品。同时可以取少量样品用Bradford法测定蛋白浓度,尽量使蛋白浓度达到1-3mg/ml,相当于每10μl待测样品中含有10-30μg蛋白。如果细胞较小,可以适当增加细胞的用量。
