Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用。其中Caspase 3是哺乳动物细胞中研究最多的一个蛋白 , 它与DNA断裂、染色质凝聚和凋亡小体形成有关。Caspase 3在正常状态下以酶原的形式存在于胞浆中 , 没有活性 ; 但在细胞发生凋亡阶段 , 它被激活 , 活化的Caspase 3由两个大亚基和两个小亚基组成 , 裂解相应的胞浆胞核底物 , 最终导致细胞凋亡。
本 试 剂 盒 是 基 于Caspase 3可 以 催 化 底 物Ac-DEVD- ρNA（acetyl-Asp-Glu-Val-Aspρ -nitroaniline） 产 生 黄 色 的 ρNA（ ρ- nitroaniline） , 从而可以通过测定吸光度来检测Caspase 3的活性。ρNA在405nm附近有强吸收峰。
试剂盒中提供了Caspase 3催化产生的黄色产物 ρNA , 可以作为定量Caspase 3酶活性的标准品。
包装信息
一、准备工作：
1. 裂解液溶解后混匀并置于冰浴上备用。
2. 检测缓冲液溶解后混匀并置于冰浴上备用。
二、测定 ρNA标准曲线：
1. 标准品稀释液的配制 : 按照每0.9ml检测缓冲液加入0.1ml裂解液的比例配制适量的标准品稀释液。
2. 把试剂盒提供的ρNA（10mM）用标准品稀释液稀释为0、10、20、50、100和200μM，作为标准品。
3. 每个浓度取100μl用酶标仪进行检测，或取适当量用容量不超过100μl的分光光度检测杯进行检测，测定A405。
4. 每一个标准品的A405减去不含 ρNA的空白对照的A405计算出实际的因 ρNA而导致的吸光度，并制作出 ρNA浓度相当于A405的标准曲线。
三、样品的收集：
1. 对于悬浮细胞：把没有诱导凋亡的对照样品和诱导凋亡的样品，1000rpm 4℃离心5min收集细胞，小心吸除上清，同时确保尽量没有细胞被吸除，PBS洗涤一次。同前吸尽上清后，按照每200万细胞加入100μl裂解液的比例加入裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解 15min。下转步骤3-4。
2. 对于贴壁细胞：吸取细胞培养液，备用。用胰酶消化贴壁细胞，并收集至备用的细胞培养液中。1000rpm 4℃离心5min收集细胞 , 小心吸除上清 , 同时确保尽量没有细胞被吸除，同前吸尽上清后，按照每200万细胞加入100μl裂解液的比例加入裂解液，重悬沉淀， 冰浴裂解15min。下转步骤3-4。
3. 对于组织样品 : 按照每10mg组织加入100μl裂解液的比例加入裂解液，在冰浴上用玻璃匀浆器匀浆。然后把匀浆液转移到1.5ml离心管中，冰浴再裂解5min。
4. 4℃ 12000rpm离心15min。
5. 把上清转移到冰浴预冷的离心管中。
6. 立即测定Caspase 3的酶活性或-70℃保存样品。同时可以取少量样品用Bradford法测定蛋白浓度，尽量使蛋白浓度达到1- 3mg/ml，相当于每10μl待测样品中含有10-30μg蛋白。如果细胞较小，可以适当增加细胞的用量。
四、Caspase 3酶活性的检测：
1. 取出ρNA和适量的Ac-DEVD- ρNA（2mM），置于冰浴上备用。
2. 如下设置反应体系：
注 : ①在设置反应体系时先加检测缓冲液 , 再加待测样品 , 适当混匀 , 注意避免在混匀时产生气泡。随后再加入10μlAc-DEVD- ρNA（2mM）。
②在测定组织样本时，可以加大样本量，一般为2-4倍。
3. 加入Ac-DEVD- ρNA（2mM）后混匀，注意避免在混匀时产生气泡。37℃孵育2-4h。发现颜色变化比较明显时即可测定A405。如果颜色变化不明显，可以适当延长孵育时间，甚至可以孵育过夜。
4. 样品的A405扣除空白对照的A405，即为样品中Caspase 3催化产生的 ρNA产生的吸光度。通过同步骤二中获得的标准曲线的对比就可以计算出样品中催化产生了多少量的 ρNA。
