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产品概述

免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)是研究蛋白质间相互作用的一种常用方法,基本原理是以细胞内源性靶蛋白为诱饵,将靶蛋白抗体与细胞总蛋白进行共孵育,促进免疫复合物的形成;随后加入能够与抗体Fc段结合的prorein A+G,形成“结合蛋白-靶蛋白-靶蛋白抗体-protein A+G小珠”复合物,纯化该复合物后凝胶电泳分离蛋白,应用Western blot或者质谱技术鉴定靶蛋白的结合蛋白。

包装信息

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操作流程

1. 除去细胞培养基,用预冷的PBS(需自备)洗涤细胞两次。

2. 加入预冷的裂解液(见表1),冰育5min。

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3. 用预冷的细胞刮将细胞从培养皿或培养瓶上刮下,把悬液转到1.5ml EP管中,缓慢晃动10min。
4. 4℃,14000×g离心15min,将上清转移至新的离心管中。
5. 准备Protein A beads,用1ml PBS清洗三次(3000×g离心1min)后保存备用,此步骤可提前准备。

6. 每1ml总蛋白中加入60μl Protein A beads,以去除非特异性杂蛋白,降低背景。 7. 4℃,14000×g离心15min,将上清转移到一个新的离心管中,去除Protein A beads。

8. 做蛋白标准曲线,测定蛋白浓度。

① 配制工作液:根据标准品和样品数量,按50体积试剂A加1体积试剂B(50:1)配制适量工作液,充分混匀。

② 稀释标准品:取10µl标准品稀释到100µl,使终浓度为0.5mg/ml。将标准品按0、1、2、4、 8、12、16、20µl加到96孔板的蛋白 标准品孔中,再用PBS补足至20µl。 

③ 加适当体积样品到96孔板的样品孔中,再用PBS溶液补足至20µl。 

④ 向各孔加入200µl工作液,37℃放置30min(也可室温放置2h)。

⑤ 用酶标仪测定A562,根据标准曲线计算出蛋白浓度。 

9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl,如果目的蛋白在细胞中含量较低,则总蛋白浓度应该稍高(如10 μg/μl)。 

10. 加入2μg抗体到500μl总蛋白中,用摇床缓慢摇动抗原抗体混合物,4℃过夜。 11. 加入60μl Protein A beads来捕捉抗原抗体复合物,室温缓慢摇动抗原抗体混合物2h。 

12. 用预冷PBS清洗三次(3000×g离心1min),收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物,弃上清 。 

13. 用20μl 5×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起,轻轻混匀,缓冲液的量依据上样多少的需要而定。 

14. 将上样样品煮沸5min,以游离抗原,抗体,珠子,3000×g离心1min,收集上清,也可以暂时于-20℃保存,留待以后电泳,电泳 前应再次煮沸5min。


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